Информация по продукту: Pcs I


Название
Pcs I
Кат. номераE505E506
Фасовки, е.а.2001000
Концентрация, е.а./мл50005000
Цена, руб550022000

Сайт узнавания
(5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G
G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC)
ИсточникИз шт амма E.coli, несущего клонированный ген PcsI I из Paracoccus carotinifaciens 3K
Субстратная специфичностьФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК
[1].

Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.

Оптимальный субстрат (активность 100%):
5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/ 3'-WG(5mC)NNNNNNNG(5mC)W-5`
Субстрат для определения активностиПлазмидная ДНК pMHpySE49, линеаризованная DriI (pMHpySE49/DriI). pMHpySE49 (3536 п.н.) получена путем лигирования вектора pMTL22/FauNDI/SmaIи ПЦР-фрагмента, содержащего ген метилазы M.HpySE526I(образует 5'-A(5mC)GT-3')и последовательность ДНК
5'-GACGT AT AAAACGTT -3'
3'-CTGCAT ATTTTGCAA-5'
В результате, данный субстрат имеет оптимальный сайт PcsI:
5'-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3'
3'-TG(5mC)NNNNNNNG(5mC)A-5' [1].
Единица активностиЗа одну единицу активности принимается количество фермент а, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpySE49/DriIза 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHpySE49/DriIи образование двух фрагментов ДНК.
Определение активности PcsI
Дорожки:
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры
2: исходная ДНК , pMHpySE49/DriI
3: 0.5 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
4: 1 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
5: 2 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
6. 1 мкл Pcs I, неразбавленный

Продукты разделены в 1% агарозном геле в буфере TAE

Оптимальный SE-буферSE-буфер PcsI (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.)
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
BGOWYRose
50 - 7550 - 750 - 1010 - 2550 - 7550
Реакционный буферSE-буфер PcsI, (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.)
Оптимальная температура
37oC
Условия хранения15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0,05% Тритон Х-100, 7 mM 2-меркаптоэтанол, 100 µg/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 2 года.
Неспецифический гидролизНеспецифического гидролиза не наблюдается при обработке 1 мкг ДНК фага лямбда 10ед фермент а в течение 16 часов при 37°С
Чувствительность к метилированиюФермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов. [1].
Инактивация 20 мин при
65oC
ПримечаниеС ферментом поставляется 10 Х SE-буфер PcsI
Литература:1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2009).