| Сайт узнавания | (5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G
G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC) |
| Источник | Из шт амма E.coli, несущего
клонированный ген PcsI I из Paracoccus
carotinifaciens 3K |
| Субстратная специфичность | Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК [1].
Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов.
Оптимальный субстрат (активность 100%):
5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/
3'-WG(5mC)NNNNNNNG(5mC)W-5` |
| Субстрат для определения активности | Плазмидная ДНК pMHpySE49, линеаризованная DriI
(pMHpySE49/DriI). pMHpySE49 (3536 п.н.) получена
путем лигирования вектора pMTL22/FauNDI/SmaIи
ПЦР-фрагмента, содержащего ген метилазы
M.HpySE526I(образует 5'-A(5mC)GT-3')и
последовательность ДНК
5'-GACGT AT AAAACGTT -3'
3'-CTGCAT ATTTTGCAA-5'
В результате, данный субстрат имеет оптимальный
сайт PcsI:
5'-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3'
3'-TG(5mC)NNNNNNNG(5mC)A-5' [1]. |
| Единица активности | За одну единицу активности принимается
количество фермент а, необходимое для полного
гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpySE49/DriIза
1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При
этом происходит исчезновение исходной линейной
формы плазмиды pMHpySE49/DriIи образование
двух фрагментов ДНК.
|
Определение активности PcsI
Дорожки:
1 и 7 - 1 Kb SE ДНК-маркеры
2: исходная ДНК , pMHpySE49/DriI
3: 0.5 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
4: 1 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
5: 2 мкл Pcs I, разбавленный в 10 раз
6. 1 мкл Pcs I, неразбавленный
Продукты разделены в 1% агарозном геле в буфере TAE
|
 |
| Оптимальный SE-буфер | SE-буфер PcsI (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.) |
| Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: | | B | G | O | W | Y | Rose | | 50 - 75 | 50 - 75 | 0 - 10 | 10 - 25 | 50 - 75 | 50 |
|
| Реакционный буфер | SE-буфер PcsI, (10 mM Tris-HCl (pH 8.3 при 25°C); 20 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT.) |
| Оптимальная температура | 37oC |
| Условия хранения | 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl,
0.1 mM EDTA, 0,05% Тритон Х-100,
7 mM 2-меркаптоэтанол,
100 µg/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Срок хранения фермента 2 года. |
| Неспецифический гидролиз | Неспецифического
гидролиза не наблюдается при обработке 1 мкг ДНК
фага лямбда 10ед фермент а в течение 16 часов при
37°С |
| Чувствительность к метилированию | Фермент расщепляет
только С5-метилированную ДНК.
Не расщепляет немодифицированную ДНК.
Активность фермента зависит от нуклеотидов,
фланкирующих сайт узнавания, и количества
метилированных цитозинов. [1]. |
| Инактивация 20 мин при | 65oC |
| Примечание | С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер PcsI |
| Литература: | 1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова Л.Н., Акишев А.Г., Дедков В.С., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pcs I. // Патент на изобретение RU 2377294 С1 (2009).
|